Метильные зонды в белках для определения режима связывания лиганда в слабом белке

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 11231 (2022) Цитировать эту статью

1067 доступов

1 Цитаты

13 Альтметрика

Подробности о метриках

Структуры комплексов белок-лиганд предоставляют важную информацию для разработки лекарств. Структуры большинства комплексов белок-лиганд определяются с помощью рентгеновской кристаллографии, но там, где кристаллография не может создать структуру комплекса, ЯМР часто является лучшей альтернативой. Однако доступные инструменты, позволяющие быстро и надежно определять структуру комплексов белок-лиганд с помощью ЯМР, в настоящее время ограничены. Это приводит к ситуациям, когда проекты либо прекращаются, либо продолжаются без структурных данных, что усложняет задачу. Ранее мы сообщали о подходе ЯМР-молекулярной замены (ЯМР2), который позволяет определять структуру комплекса белок-лиганд, не требуя выполнения громоздкой задачи определения резонанса белка. Здесь мы описываем подход ЯМР2 для определения положения связывания небольшой молекулы в слабом комплексе белок-лиганд путем сбора разреженных белковых NOE от метила к лиганду из селективно меченного образца белка и немеченого лиганда. В схеме селективного мечения все метилсодержащие остатки белка протонируются на дейтерированном фоне. Это позволяет измерять межмолекулярные NOE с большей чувствительностью, используя стандартные последовательности импульсов NOESY вместо экспериментов ЯМР с изотопной фильтрацией. Этот подход к мечению хорошо подходит для подхода ЯМР2 и расширяет его возможности, включая более крупные комплексы белок-лиганд.

Разработка лекарств на основе структуры оказалась очень эффективной в процессе оптимизации1. Рентгеновская кристаллография является предпочтительным методом получения структурных данных2. Хотя кристаллизация обычно хорошо работает с лигандами с высоким сродством, те, которые слабо связываются, могут оказаться более сложными. Когда комплекс не кристаллизуется, ЯМР может предоставить альтернативный подход для получения структурных данных. Однако время, необходимое для создания структуры с помощью ЯМР, часто оказывается слишком долгим для проектов в области медицинской химии. В последние годы были разработаны многочисленные методы ЯМР, которые позволяют определить способ связывания лиганда3. Возмущение химического сдвига (CSP)4,5,6,7, перенос насыщения8, частичное отнесение резонанса ЯМР9 и подходы псевдоконтактного сдвига10,11 — вот несколько методов решения этой проблемы12,13,14. Ранее мы сообщали о методе определения структуры сайта связывания белок-лиганд, называемом молекулярной заменой ЯМР, NMR2. Этот метод может генерировать точные структуры сайта связывания белок-лиганд в течение нескольких дней15,16,17. Для NMR2 не требуются назначения ни основной, ни боковой цепи. Вместо этого этот метод использует полудвусмысленные межмолекулярные NOE белок-лиганд и внутрилигандные NOE в качестве экспериментальных входных данных в сочетании со стартовой моделью белка для расчета связанной структуры. Расчеты структуры основаны на стандартных протоколах ЯМР, а результаты ранжируются в соответствии с согласием между экспериментальными входными данными и расчетной структурой. ЯМР2 является систематическим методом и, следовательно, не содержит стохастической составляющей. Он также опирается не на рецепты стыковки, а на серию надежных протоколов расчета конструкции. ЯМР2 можно использовать для решения нескольких различных типов сложных структур, включающих сильные и слабые связующие, небольшие молекулы, пептиды и пептидомиметики15,16,17. Этот метод также способен обнаруживать загадочные карманы связывания15,16,17. Здесь мы подробно рассказываем об использовании ЯМР2 в сочетании со специфическими схемами метильной маркировки на дейтерированном фоне (см. дополнительный рисунок S1). Преимущество специфических схем мечения метила в ЯМР белков, где метильные группы протонируются на дейтерированном фоне, позволяет изучать системы с гораздо более высокой молекулярной массой из-за благоприятных релаксационных свойств метильных групп18,19. Кроме того, возможно стереоспецифическое мечение метильных групп, что снижает неоднозначность резонансных назначений белков.